DNA和RNA浓度检测实验:基本原理
DNA链或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。当波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD 260 不仅与总含量有关,也随构型而有差异。
对标准样品来说,浓度为1μg/ mL时,DNA钠盐的OD 260 =0.02;当OD 260 =1时,dsDNA浓度约为50μg/ mL;ssDNA浓度约为37μg/ mL;RNA浓度约为40μg/ mL;寡核苷酸浓度约为30μg/ mL。
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下,应同时检测同一样品的OD 260 、OD 280 和OD 230 ,计算其比值以衡量样品的纯度。
纯DNA的OD经验值:OD 260 / OD 280 ≈1.8(大于1.9,表明有RNA污染;小于1.6,表明有蛋白质、酚等污染)
纯RNA的OD经验值:1.7<OD 260 / OD 280 <2.0(小于1.7时表明有蛋白质或酚污染;大于2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。一般地,OD 260 / OD 280 的值用于估计核酸的纯度;OD 260 / OD 23 0 的值用估计去盐的程度。对于RNA纯制品,其OD 260 / OD 280 ≈2.0,OD 260 / OD 23 0 >2。若OD 260 / OD 280 <2.0,则可能是蛋白污染所致,此时可以增加酚抽提。若OD 260 / OD 23 0 <2,则说明去盐不充分,此时可以再次沉淀并用70%乙醇洗涤。