原位合成芯片（light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays）采用的是光引导聚合技术，在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸探针，其方法不同于上述两种芯片的点样技术。

原位合成芯片的探针制备过程：

先将基片支持物（wafer）羟基化，然后用对光敏感的保护基团将羟基基团保护起来。每次选取特制的光掩膜（mask）覆盖在基片上，遮挡不需要合成的部位。当光通过光掩膜照射到基片上时，需要聚合的部位透光，受光照射部位的羟基去保护而活化。

然后加入3’端活化（5’羟基末端连接光敏保护基团）的单一核苷酸单体底物后，发生偶联反应。在一轮反应之后更换另一张光掩膜来控制活化区域，并换另一种核苷酸单体实现在特定位点合成预定的序列寡聚体。

每次通过控制光掩膜（决定哪些区域应被活化）以及所用核苷酸单体的种类和反应次序就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。光掩膜的设计和严格的工艺流程使制造的芯片具有高密度、高重复性和一致性。

原位合成芯片为单通道芯片，即只使用一种荧光分子对样本进行标记，通过检测荧光强度获得基因的表达水平。由于寡核苷酸探针长度较短（一般为15～25个碱基），对于某个待检测的基因通常需要设计多个相互重叠的探针构成探针集，从而有效减少探针杂交非专一性的影响。

该类芯片的主要优势在于所有探针都是在一个条件下完成的，因此同一批芯片的探针浓度均一性较好；此外，由于该类芯片的探针合成和芯片制备是同时进行的，探针不需要预先合成，所以避免了点样芯片中探针的降解情况，从而保证了实验的重复性；

同时，考虑到探针的非特异性杂交问题，该类芯片通常针对每段参考序列（reference sequence）设计一对寡核苷酸探针，其中一个是完全匹配（perfect match，PM）的探针，另一个是中间有一个碱基错配（mismatch，MM）的探针，计算时将每对PM-MM探针的检测信号综合起来，这样有助于区分特异性结合与非特异性结合的靶片段，从而提高探针灵敏度和特异性。这种PM-MM设计对于复杂序列背景样品中低丰度表达产物的检测有明显优势。