常用蛋白质的分离技术有哪些?

(一)双向凝胶电泳

1.第一相等电聚焦

根据蛋白质的等电点不同而分离,在此方法中引入固相pH梯度技术(immobilized pH gradient, IPG)。其特点(或优点):

(1)等电点单位小,仅有0.001pH单位差别的蛋白质分离;

(2)pH梯度稳定;

(3)精确度高;

(4)无阴极漂移;

(5)无碱性蛋白质丢失现象;

(6)蛋白质上样大及可提高低含量成分的分辨效果;

(7)一般上样量在50~100μg;

(8)样品中盐的干扰少;

(9)无边缘效应;

(10)pH梯度、分离结果的重复性好等。

2.第二相SDS-PAGE

其中SDS为十二烷基硫酸钠的英文缩写,SDS是一种去污剂,可使蛋白质亚基包绕上一层负电荷。第二相电泳的作用是通过电荷效应和相对分子质量的大小的不同,把等电点相同而相对分子质量不同的一组蛋白质分离开。

3.双向电泳操作

双向电泳步骤一般包括:样品制备、IEF电泳、平衡、SDS-PAGE、染色、分析和保存等环节。

4.2-DE后分析

电泳图谱分析,一般性步骤用图像扫描仪将蛋白质斑点数字化,用图像分析系统对凝胶图谱去除纹理及背景,找出表达上有差异的蛋白质斑点及半定量,从而发现有生物学意义的蛋白质。

5.仪器设备

电泳仪、电泳槽、特殊试剂、图像分析系统、分析软件。

6.2-DE的应用领域

(1)可溶性蛋白质,且无mRNA存在,如体液。

(2)蛋白质的丰度与mRNA的浓度不一致时。

(3)翻译后的研究。

(4)被分析的蛋白质恰是高丰度蛋白质。

(5)仅含单一蛋白质组的样品的研究,如某一种微生物。

7.2-DE的局限性

(1)SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。

(2)疏水性的蛋白质,因不能溶于SDS而不适合做2-DE,如一些跨膜蛋白质常为药物作用的靶点。

(3)pl值<3或>11的蛋白质。

(4)相对分子质量过大(>100000DW)或过小(<10000DW)的蛋白质。

(5)低丰度蛋白质(<1ng,如一些调控蛋白对于基础与应用研究甚至比高含量结构蛋白更重要)都很难被测到。

(6)样品上样量相对少,使检测的灵敏度受到限制。

(7)电泳结果需经染色处理,不能直接分析,不同蛋白质与染料的结合差异较大。

(8)不能高通量分析,且耗时。

(9)目前尚不能实现自动化处理。

8.对低丰度蛋白质的分析方法

(1)电泳前对样品进行处理,根据溶解度进行分离,取感兴趣溶解度的蛋白质进行电泳。

(2)等电聚焦筛选,先进行粗略等电聚焦,取感兴趣等电点范围的蛋白质,再进行较窄pH范围的2-DE。

(3)解除遮蔽的方法,针对低含量蛋白组分易被高含量组分遮蔽而降低分辨率的问题,可利用Bio-Rad公司的protoclear TM技术将血清中的白蛋白及球蛋白去除,可取得较好的结果。

(4)激光捕获微解技术(laser capture micro dissection, LCA),局部与整体结果比较,集中丰度。

(二)高效液相色谱(HPLC)

该技术可使单一蛋白质得到高灵敏度的分析,单纯应用于蛋白质组研究,其存在明显不足:1.不能定量分析,如蛋白质的差异表达分析;2.对过酸及相对分子质量太小的蛋白质不能分离。

当多维联用HPLC时:1.有较高的灵敏度;2.蛋白质样品不需变性处理可直接分离;3.自动上样、自动收集、自动在线分析;4.不需对分离结果进行染色处理,常用于蛋白质组分少于1000道尔顿、膜蛋白及低丰度蛋白质的分离。

(三)差异凝胶电泳

差异凝胶电泳用来检测蛋白质在两种样品中的表达情况。方法:对两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合,进行2-DE,荧光显微镜下观察。从差异凝胶电泳的结果中,可观察到:1.如果同一个斑点显示两种荧光,说明一种蛋白质同时在两个样品中表达。2.如果同一斑点只显示一种荧光,则说明该蛋白质只在相应的一种样品中表达。依此,可对来自同一类正常组织和病变的(如癌)组织的样品蛋白质表达差异进行分析。

(四)毛细管电泳技术

毛细管电泳(CE)技术包括:毛细管区带电泳(CZE),毛细管等电聚焦电泳(CIEF);筛板-SDS-毛细管电泳。

1.毛细管区带电泳(CZE)

毛细管区带电泳(CZE)工作原理:主要根据不同蛋白质的电荷质量比差异进行分离。文献报道:CZE分离人血白蛋白、尿蛋白可得到数十个组分;可溶性小麦蛋白可得到30~40个组分,其分离效果与传统SDS-PAGE基本相当。

2.毛细管等电聚焦电泳(CIEF)

毛细管等电聚焦电泳(CIEF)工作原理:根据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度而进行分离。

3.筛板-SDS-毛细管电泳

筛板-SDS-毛细管电泳工作原理:根据SDS-蛋白质复合物在网状骨架中的迁移率不同而进行分离。

CE与2-比较:(1)CE可实现在线自动化分析;(2)CE可用于蛋白质相对分子质量范围不适于2-DE的样品分析;(3)CE的缺点在于对复杂的样品分离不完全。

(五)同位素标记亲和标签法

同位素标记亲和标签法(isotope-coded affinity tags, ICAT)原理:是指用轻同位素和重同位素分别标记正常人和病人样品的蛋白质,然后用质谱仪定量检测病人蛋白质的表达变化。

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