【实验原理】
细胞膜是脂质双分子层镶嵌蛋白质的结构,胞间侧表面有分支状糖外被,细胞与细胞之间的相互识别和联系、细胞的生长、细胞的分化、机体的免疫反应及肿瘤的发生等都与其有关。凝集素是一类含糖并能与糖基特异性结合的蛋白质,它能与细胞表面的糖分子相连接,在细胞间形成“架桥”,从而使细胞凝集。凝集素既可以促使细胞凝集,又能刺激细胞分裂。
【实验器材】
1.实验材料
家兔、土豆、韭菜、半夏、1%肝素溶液、PBS缓冲液、固体硫酸铵。
2.实验仪器
显微镜、天平、烧杯、研钵、载玻片、滴管、离心管、注射器等。
【实验步骤】
1.实验准备
(1)1%家兔红细胞悬液制备 用5mL注射器(含1%肝素溶液)抽取家兔耳缘静脉血液1mL,用生理盐水洗3次,每次离心5分钟(2000r/min)收集红细胞,最后按红细胞比容用生理盐水配成1%家兔红细胞悬液。
(2)凝集素制备
①土豆凝集素制备:用天平称取去皮土豆2g,切成小片置烧杯中,加入10mLPBS缓冲液浸泡1~2小时,可溶性的土豆凝集素即溶解于PBS缓冲液中,取出土豆,溶液备用。
②韭菜凝集素制备:用天平称取洗净的韭菜4g,剪碎,加入4mL生理盐水,充分研磨,过滤,滤液5000r/min离心10分钟,转移上清,弃去沉淀,加入硫酸铵(约0.4g/mL),5000r/min离心10分钟,弃上清,加入0.25mLPBS缓冲液溶解沉淀。
③半夏凝集素制备:用天平称取半夏2g,切成小块置研钵中研磨,加入5mLPBS缓冲液,过滤,滤液备用。
2.凝集反应
取4张载玻片,各滴一滴1%家兔红细胞悬液,之后分别滴加土豆凝集素、韭菜凝集素、半夏凝集素及PBS缓冲液各一滴于载玻片上,充分混匀,静置10分钟,低倍显微镜下观察红细胞凝集现象。
【实验预期结果及分析】
1.土豆、韭菜、半夏的凝集素均能使红细胞凝集。
2.PBS缓冲液为阴性对照,红细胞分散均匀,无明显变化。
【要点提示及注意事项】
1.韭菜凝集素提取中,韭菜一定要研磨充分,且加硫酸铵时要足量,否则会影响沉淀效果。
2.离心管放入离心机时,要先配平,然后对称放置在离心机内。