芽孢杆菌生长曲线测定实验:基本原理

芽孢杆菌(Bacillus)是一种细菌,在不良环境下能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。该类细菌对外界胁迫因子有很强的抵抗力,广泛分布在空气、土壤、水体以及动植物体内。通过芽孢杆菌生长曲线的测定可以掌握和了解细菌繁殖世代所需时间和生长规律。理论上,芽孢杆菌繁殖世代所需时间为31min。

将芽孢杆菌孢子菌悬液按1%体积接种到一定体积的灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基,并置于恒温培养箱中于37℃条件下培养24h后,定时取样并测定其细胞数量。以活菌数的对数为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制一条如图5-1所示的生长曲线,该曲线称为芽孢杆菌的生长曲线(Bacterial Growth Curve)。该曲线显示了芽孢杆菌生长繁殖的4个时期:迟滞期、对数期、静止期和衰亡期。

图5-1 芽孢杆菌的生长曲线

迟滞期(Lag Phase):又叫调整期。当细菌接种至新鲜培养基后,不会立即生长和繁殖,而是对新环境有一个短暂的适应过程,经过一段时间适应后才能在新的培养基中生长和繁殖。在此时期初始阶段,部分细菌会因不适应新环境而死亡;部分细菌则为了适应新环境,体内产生相应的酶促使细胞生长;当完全适应新环境后,细菌的生长和繁殖速率开始增大,细菌总数也开始增加。不同细菌具有不同的迟滞期,外界因素对迟滞期的影响较大。例如,接种量小,迟滞期长;营养丰富,迟滞期短;细菌菌龄处于对数期,迟滞期也短。

对数期(Logarithmic Phase):又称指数期。该时期的活菌数直线上升,并呈几何级数快速增加,这个时期的细菌由于营养丰富,其细胞代谢活力最强,合成新细胞的速率也最大,细菌群体中化学组分及形态、生理特性都比较一致。一般的教学实验都采用对数期的细胞作实验材料,大型发酵也采用对数期的细胞来提取代谢产物。由于该时期细菌细胞的形态、活力及活性都很典型,对外界环境因素的作用敏感,因此在该时期利用抗生素的效果最佳。

静止期(Stationary Phase):又称为稳定器。这个时期的细菌生长相对平稳。处于对数期的细菌生长和繁殖迅速,消耗了培养基内的大部分营养物质,导致培养基中的营养成分快速下降。在该时期,细菌在生长发育时积累了大量的代谢产物,而代谢产物的产生对细菌具有毒性,同时,溶解氧的缺乏、pH和氧化还原电位的变化也会使细菌生长受阻,最终导致细菌的生长速率下降,死亡率逐渐增加。该时期细菌产生的新细菌数和死亡的细菌数基本相当,细菌的总数达到最大值,并能维持一定的时间。在常规的活性污泥污水处理时,一般采用静止期的微生物细胞。

衰亡期(Decline Phase):又称衰老期。细菌经过静止期后,由于营养物质的耗尽,细菌因营养的缺乏而不得不利用自身储存的物质进行内源性呼吸,此时,细菌在代谢过程中会因产生有毒的代谢产物而抑制细菌的生长和发育,细菌繁殖速率明显下降,死亡的细菌数明显增加,甚至死亡的细菌数数量大于新生活菌数,这表面细菌的生长进入衰亡期。衰亡期的细菌形态多样,部分细菌会产生芽孢。

常见的测定微生物生长量的方法有体积测量法、称干重法、血球计数板法、比浊法等,本实验采用的是比浊法。微生物的生长繁殖会增加培养液的混浊度。由于光密度(OD值)与细菌菌悬液的浓度成正比,因此,可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来计算菌悬液的浓度,以培养时间为横坐标,OD值为纵坐标作图,可描绘细菌在一定环境条件下的生长曲线。计算芽孢杆菌的世代时间的公式为

式中, 表示世代时间; 和 表示对数期两点的时间; 和 分别表示对应时间测得的OD值。

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