铜对辣根过氧化物酶活性的影响:实验原理

随着现代工业的不断发展,危害环境的有毒有害化学物质种类和数量越来越多,它们对环境、生态系统的影响也越来越严重。对于鉴定这些化合物对生物体的危害,传统的生物体毒性实验已经越来越难以满足这种要求。暴露于污染物的生物体在生物化学水平上的改变可反映污染物对生物早期作用,因而可作为灵敏的指标,即分子生态学指标,来检测污染物对生物个体、种群的早期影响,从而达到保护生物及生态系统的目的。

一旦暴露于污染物,有机体常常直接代谢和净化污染物,以减少所受的分子损伤。许多外源性化合物在代谢过程中参与生物体内的氧化还原循环,产生大量的活性氧自由基(ROS)。生物自身的体内代谢反应,线粒体、微粒体和色素体的多酶电子传递链以及白细胞的吞噬作用等也会产生副产物ROS。活性氧是带有2~3个电子的分子氧化还原产物,主要有·OH,O – 和H 等。这些活性氧攻击生物分子,导致蛋白质、DNA和脂质的损伤,最终导致其失活。在长期进化中,需氧生物发展出防御氧化损伤的系统,以控制ROS在稳定的低水平。这些保护系统包括过氧化物酶(POD),作为植物代谢的末端氧化酶之一,它们在清除自由基、控制膜脂过氧化作用和保护细胞膜的正常代谢方面起着重要的作用。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)就是其中一种常见的过氧化物酶,由于其广泛应用于医学诊断技术并且具有许多潜在的医疗应用前景,所以辣根过氧化物酶也是过氧化物酶家族中研究最为透彻的酶之一。

实验原理

辣根(horseradish)是一种长年生香草,它的根含有丰富的过氧化物酶,这种酶常被称为“辣根过氧化物酶”(horseradish peroxidase,HRP)。辣根的根部含有很多此酶的同工酶,而“辣根过氧化物酶”则是这些同工酶的总称,其中以辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)的含量最为丰富。

辣根过氧化物酶同工酶C的二维结构在20世纪70年底已被探明,是一条由308个氨基酸组成的肽链氨基酸序列,其三维结构也在1997年被确定,大部分是 α 螺旋,也包含一些小的 β 折叠。HRPC含有两个不同的金属中心:正铁原卟啉(即血红素)和两个钙原子。这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。

在植物体内,辣根过氧化物酶催化过程可以用下面化学方程式表示:

其中AH是还原性底物,·A是自由基,还原性底物包括芳香族化合物、酚类化合物、吲哚、胺类和磺酸盐等。在HRP催化反应中,自由基的形成暗示了HRP在植物体细胞内中所起的作用。这些功能可能包括一些正常的交联反应,也可能是遇到一些外部因素时,如植物组织受到创伤,但是HRP在体内的作用并没有完全被阐明。

反应(22-1)也被应用于酚类、芳香胺类废水的处理。该反应的效率会因金属离子影响辣根过氧化物酶活性而被影响,并且利用无机离子对辣根过氧化物酶的抑制作用,实现了对Cd 2+ ,Co 2+ 和Cu 2+ 等的浓度测定。

辣根过氧化物酶的活性可以通过其催化H 氧化四甲基联苯胺(TMB)的速率来表征。辣根过氧化物酶与TMB反应后使溶液呈蓝色,加入硫酸反应终止,此时溶液呈黄色,在450 nm处有吸收峰。在该反应的初始阶段,反应体系吸光度随反应时间均匀增加,吸光度的变化率作为反应速率,用于表示HRP的酶活性的大小。在反应体系中加入一定浓度的Cu 2+ ,根据反应速率的变化可以研究铜对辣根过氧化物酶活性的影响。

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