菌体内能的代谢包括生物氧化和生物合成两个方面。能量生成受干扰，即物质的氧化或生物呼吸受影响，对菌体来说打击是沉重的，起致死作用。多作用位点的传统杀菌剂多数是这种作用。

菌体不同生长发育期对能量的需要量是不同的，孢子萌发比维持生长所需的能量大得多，因而能量供应受阻时，孢子就不能萌发。菌赖以生存的能量来源于其体内糖、脂肪或蛋白质的降解。在菌体内物质的降解有三个途径：酵解、有氧氧化和磷酸戊糖途径。由于糖酵解提供的能量很少，杀菌剂干扰这个代谢途径对防治植物病害的意义不大。杀菌剂对菌体内能生成的影响主要是对有氧呼吸（即有氧氧化）的影响，包括对乙酰辅酶A形成的干扰、对三羧酸循环的影响、对呼吸链上氢和电子传递的影响以及对氧化磷酸化的影响。由于有氧呼吸是在线粒体内进行，因而许多对这种细胞器有破坏作用的杀菌剂，都会干扰有氧呼吸而破坏能量生成。

（1）对乙酰辅酶A形成的影响

糖降解产生丙酮酸而透入线粒体，在丙酮酸脱氢酶系的作用下形成乙酰辅酶A，然后进入三羧酸循环进行有氧氧化。有机硫杀菌剂克菌丹是对乙酰辅酶A形成带有特异性反应的药剂，作用点是丙酮酸脱氢酶系中的硫胺素焦磷酸（TPP）。TPP在丙酮酸脱羧过程中起转移乙酰基的作用，而TPP接受乙酰基时只能以氧化型（TPP ⁺ ）进行，但有克菌丹存在的情况下，TPP ⁺ 结构受到破坏，失去转乙酰基的作用，乙酰辅酶A不能形成。

（2）对三羧酸循环的影响

三羧酸循环是在线粒体内进行，参与三羧酸循环每个过程的作用酶都分布在线粒体膜、基质和液泡中。因而杀菌剂对三羧酸循环的影响主要是对这些关键酶活性的抑制，使代谢过程不能进行。例如，福美双、克菌丹、硫磺、二氯萘醌等会使辅酶A失活；有机硫代森类和8-羟基喹啉等会与菌体三羧酸循环中的乌头酸酶螯合，使酶失去活性；克菌丹使酮戊二酸脱氢酶活性受阻，是由于克菌丹破坏了此脱氢酶的辅酶-TPP硫胺素焦磷酸的结构；硫磺、萎锈灵会抑制琥珀酸、苹果酸脱氢酶的活性；含铜杀菌剂会抑制延胡索酸酶的活性。

（3）对呼吸链的影响

ATP是生物体能量储存“库”，在生物体中ATP主要在呼吸链中三个位点形成，因此，对呼吸链中电子传递的干扰是杀菌剂的重要作用机理之一。呼吸链的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个部位都有杀菌剂的作用位点。例如：敌枯双是通过抑制辅酶Ⅰ的合成而破坏呼吸链的功能；敌克松则会强烈抑制辅酶Ⅰ与呼吸链细胞色素C氧化酶之间的电子传递；萎锈灵则作用于复合物Ⅱ中琥珀酸脱氢酶系到辅酶Q之间的非血红铁硫蛋白。

（4）对脂质氧化的影响

对脂质氧化的影响也是杀菌剂作用机理之一。在菌体内脂质氧化主要是β-氧化，而β-氧化必须有辅酶A参与，所以会影响辅酶A活性的杀菌剂如克菌丹、二氯萘醌等都会影响脂肪的氧化。