除草剂的作用机理比较复杂，有些除草剂主要有一种作用机制，多数除草剂涉及到植物的多种生理生化过程。除草剂的作用机理主要有如下几种。

1．抑制光合作用

目前，已知除草剂的作用部位是以下三个部位。

① 阻断电子由QA到QB的传递，使QB钝化，因此也就阻断了电子传递。大部分光合作用抑制剂作用于此部位，如取代脲类、三氮苯类、尿嘧啶类等。

② 抑制光合磷酸化反应。在光合作用中，光能通过叶绿体最终转化为化学能，即产生ATP。除草剂苯氟磺胺属解偶联剂，影响光合磷酸化作用，抑制ATP的生成。一些酚类、腈类药剂也作用于光合磷酸化反应。1，2，3-硫吡唑基-苯脲类属于能量转换抑制剂，直接作用于磷酸化部位。

③ 截获过渡到NADP ⁺ 上的电子。季铵盐类除草剂敌草快和百草枯，可充当电子传递受体，从电子传递链中争夺电子，作用于PSI中充当铁氧还蛋白（Fd）的作用，使正常传递到NADP ⁺ 中的电子被截获，而影响NADP ⁺ 的还原，与此同时，敌草快、百草枯争夺电子后被还原，还原态的敌草快、百草枯可自动氧化产生相应的阳离子，同时产生超氧根阴离子，这种有害物质可致使生物膜中的未饱和脂肪酸产生过氧化作用，最后迅速造成细胞死亡，即表现杂草枯死。

2．破坏植物的呼吸作用

除草剂通常不影响植物的糖酵解与三羧酸循环，主要影响氧化磷酸化偶联反应，致使不能生成ATP。有些除草剂就是典型的解偶联剂，如五氯酚钠、二硝酚、二乐酚、碘苯腈与溴苯腈等。此外，如敌稗、氯苯胺灵及一些苯腈类等也具有解偶联性质，当五氯酚钠等解偶联剂作用于氧化磷酸化部位后，由ADP生成ATP的反应受到抑制，于是ADP维持在高浓度水平，增强了植物的呼吸作用，但却不能生成ATP去满足植物生活的能量需要，植物终因正常代谢受破坏而死亡。

3．抑制植物的生物合成

（1）抑制色素的合成

① 抑制叶绿素的生物合成及脂膜的破坏，二苯醚类、环亚胺类除草剂的靶标酶为叶绿素合成过程中的原卟啉原氧化酶。

② 抑制类胡萝卜素的生物合成，有些除草剂可以抑制类胡萝卜素合成，致使叶绿素失去保护色素，而出现失绿现象。如广灭灵、哒草伏、嘧啶类、哒嗪酮类等除草剂，它们各自作用部位不同。

（2）抑制氨基酸、核酸和蛋白质的合成

① 抑制氨基酸的合成。目前已开发并商品化的抑制氨基酸合成的除草剂有有机磷类、磺酰脲类、咪唑喹啉酮类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等。常用的含磷除草剂有草甘膦、草铵膦和双丙氨膦。草铵膦的作用部位是抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮酸基莽草酸-3-磷酸酯合成酶，使苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸等芳族氨基酸生物合成受阻；草铵膦和双丙氨膦则抑制谷氨酰胺的合成，其靶标酶为谷氨酰胺合成酶；磺酰脲类、咪唑喹啉酮类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等除草剂的作用靶标为乙酰乳酸合成酶。

② 干扰核酸和蛋白质的合成。除草剂抑制核酸和蛋白质的合成主要是间接性的，已知干扰核酸、蛋白质合成的除草剂几乎包括了所有重要除草剂的类别，例如苯甲酸类、氨基甲酸酯类、酰胺类、二硝基酚类、二硝基苯胺类、卤代苯腈、苯氧羧酸类和三氮苯类等。

③ 抑制脂类的合成。目前，已知芳氧苯氧基丙酸酯类、环己烯酮类和硫代氨基甲酸酯类除草剂是抑制脂肪酸合成的重要除草剂。

4．干扰植物激素的平衡

激素型除草剂是人工合成的具有天然植物激素作用的物质，如苯氧羧酸类、苯甲酸类和毒萎定类等，这些化合物都很稳定，进入植物体后，会打破原有的天然激素的平衡，因为严重影响植物的生长发育。

5．抑制微管与组织发育

二硝基苯胺类除草剂是抑制微管的典型代表，他们与微管蛋白结合并抑制微管蛋白的聚合作用，造成纺锤体微管丧失，使细胞有丝分裂停留于前期或中期，产生异常的多形核。由于细胞极性丧失，液泡形成增强，故在伸长区进行放射性膨胀，结果造成根尖肿胀。苯氧羧酸类及苯甲酸类除草剂往往抑制韧皮部与木质部发育，阻碍代谢产物及营养物质的运转与分配，造成形态畸形。