形态毒理学研究是杀菌剂作用方式研究中的一个重要方面。通过形态毒理学研究，可以直观的了解杀菌剂的作用方式，为进一步研究杀菌剂作用机理奠定良好的基础。苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵、苯菌灵）的杀菌机理是其与β -微管蛋白结合，从而干扰微管的形成和有丝分裂。本实验通过观察多菌灵对禾谷镰孢菌分生孢子萌发及菌丝有丝分裂的影响，了解多菌灵对禾谷镰孢菌的作用方式。

【实验目的】

通过本实验，熟悉和掌握多菌灵对禾谷镰孢菌细胞形态毒理学的研究方法和操作步骤，以及实验结果分析等。

【实验原理】

苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵、苯菌灵）的杀菌机理是其与β-微管蛋白结合，从而干扰微管的形成和有丝分裂。通过观察多菌灵对禾谷镰孢菌分生孢子萌发及菌丝有丝分裂的影响，了解多菌灵对禾谷镰孢菌的作用方式。

【实验材料】

① 供试菌株：禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。

② 改进Helly’s液：5％升汞，3％重铬酸钾，使用时加入0.018％的甲醛。

③ 供试药剂：0.01％多聚赖氨酸，5％升汞，3％重铬酸钾，0.018％的甲醛，70％乙醇，1mol/L盐酸。

【实验设备及用品】

生化培养箱，显微镜，酒精灯，三角瓶，培养皿，打孔器，擦镜纸，玻璃纸等。

【试剂配制】

① 98％多菌灵（carbendazim）原药：溶于0.1mol/mL 的盐酸溶液中制成5000μg/mL的母液。

② 改进Helly’s液：5％升汞，3％重铬酸钾，使用时加入0.018％的甲醛。

③ Giemsa染液：Giemsa原液（Giemsa染料1g，甘油50mL，甲醇50mL），使用时用0.05mol/L的磷酸缓冲液PBS（pH 7.0）稀释10倍成Giemsa染液。

【实验步骤】

（1）禾谷镰孢菌分生孢子悬浮液的制备

菌株在PDA平板25℃培养3d，沿菌落边缘取10块菌碟接种3％绿豆汤液体培养基，25℃，175r/min；摇培7d后双层擦镜纸过滤，3500r/min离心5min，收集沉淀，灭菌水清洗2次；最后用灭菌水调节孢子浓度至1×10 ⁶ 个/mL。

（2）多菌灵对禾谷镰孢菌分生孢子萌发的形态学和细胞学观察

将分生孢子涂在经0.01％多聚赖氨酸处理的盖玻片上，风干，立即倒置放在铺有玻璃纸的含10μg/mL多菌灵的PDA平板上，25℃萌发6h、12h、24h，分别取下盖玻片，Giemsa染色观察幼殖体形态和有丝分裂，同时以不含多菌灵的PDA平板作对照。

Giemsa染色步骤如下。

① 固定。改进Helly’s液固定10min，然后用70％的乙醇漂洗3次。

② 水解。将固定后的样品放入1mol/L的盐酸中，60℃水解8min，蒸馏水清洗3次。

③ 染色。将水解后的样品放入Giemsa染液染色30min，染液封固，指甲油封片。

（3）多菌灵对禾谷镰孢菌菌丝体的形态学和细胞学观察

将分生孢子涂在经0.01％多聚赖氨酸处理的盖玻片上，风干，立即倒置放在铺有玻璃纸的PDA平板上；25℃萌发6h，然后将盖玻片移到含10μg/mL多菌灵的PDA平板上，25℃继续培养0～2h；间隔30min分别取下盖玻片，Giemsa染色观察幼殖体形态和有丝分裂，同时以不含多菌灵的PDA平板作对照。

【结果与分析】

观察多菌灵在禾谷镰孢菌不同生长阶段（分生孢子萌发、菌丝体生长）对其有丝分裂的影响，注意禾谷镰孢菌分生孢子萌发过程中的核相变化。

【注意事项】

（1）孢子的浓度调节到1×10 ⁶ 个/mL，不宜过高，也不宜过低。

（2）Giemsa染液要现配现用。