酵母蔗糖酶的结晶:实验原理

将含有一定盐浓度的缓冲液与含有低于这种盐浓度的蛋白质混合溶液在一个密封体系内一起蒸发扩散,最后达到平衡;使蛋白质溶液内盐浓度提高,而pH接近待结晶蛋白质等电点的缓冲液又使中性盐对蛋白质的盐析作用更为显著,因此导致蛋白质溶解度降低,溶液逐渐达到过饱和而析出结晶。

常用的蛋白质结晶方法有微池法结晶、蒸汽扩散法、液-液扩散法和透析结晶法等。现有的结晶方法结晶量小,需要使用高度纯化的蛋白质,常使用离子交换或亲和层析等方法进行纯化。常用的结晶剂包括盐、有机溶剂、聚乙二醇等。与酶三维结构研究相比,用作交联酶晶体催化剂的酶晶体对晶体质量要求相对较低,但要求数量大。从纯化程度较低的酶液中结晶酶,其结晶时间可能较短,结晶液可达数升至数百升,所用试剂相对较少,从而大幅度降低酶晶体的成本。

硫酸铵-丙酮协同沉淀要优于单独硫酸铵分级沉淀和丙酮沉淀,可能是因为:

①硫酸铵和丙酮分级沉淀的机理不同,硫酸铵是中和蛋白质的表面电荷使其沉淀,而丙酮是降低溶液的介电常数使其沉淀,两者在协同沉淀时作用互补,效率更高;

②当单独使用硫酸铵沉淀时,随着其饱和度的升高,溶液的密度也变大,不利于离心分离,而加入一定体积丙酮后,溶液的密度降低,有利于离心分离。

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