质粒DNA转化大肠杆菌:实验原理

外源DNA导入宿主细胞的过程称为转化。重组DNA技术中,经常需要将质粒DNA转入大肠杆菌宿主细胞,以实现质粒DNA的保存、扩增或外源基因的表达。

大肠杆菌细胞在转化前,必须经过特殊处理制备成感受态细胞,以增加转化效率。感受态细胞的制备方法有多种,分别适用于不同的转化方法。实验室中常用氯化钙(CaCl )溶液制备大肠杆菌感受态细胞,然后使用42℃热冲击的方法进行质粒DNA或连接产物的转化。

利用冰冷的CaCl 溶液处理对数生长期的大肠杆菌细胞,可以使大肠杆菌的细胞膜通透性等方面发生变化,成为易于被外源DNA转化的感受态细胞。将大肠杆菌感受态细胞与质粒DNA混合均匀,可以使质粒DNA吸附在细胞表面,经过42℃的短暂热冲击,可以促使一部分DNA进入细胞内,完成对大肠杆菌细胞的转化。

这一转化方法的转化效率比较低,所以必须结合质粒DNA上携带的筛选标记对转化后得到的细胞进行筛选。一般最常用的筛选标记是抗生素抗性标记,被成功转化的细胞可以表达作为标记使用的抗生素抗性基因,从而在具有相应抗生素的培养基上生存下来。其他未被成功转化的细胞不具备对该抗生素的抗性,则不能在具有抗生素的培养基中存活。

本实验以pET32a-SmPR10质粒为例,将其转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞。由于pET32a质粒载体上携带有氨苄青霉素抗性基因,因此对转化后得到的细胞采用含氨苄青霉素的培养基筛选。只有成功被质粒转化的细胞才能表达氨苄青霉素抗性基因,从而在抗性培养基上生长,形成可见的白色菌斑。

如果使用其他质粒或连接产物DNA对大肠杆菌细胞进行转化,与本实验步骤类似,只是需要选择与所用质粒载体对应的正确筛选方法。

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