DNA由于骨架结构中含有磷酸基团，在电泳缓冲液中带负电荷，电泳时向正极移动。琼脂糖凝胶为网络状结构，DNA分子在其中移动的速度与DNA的大小和构型有关。不同大小的DNA分子在电场中泳动速度不同，相同大小但构型不同的DNA分子泳动速度也不同，因此可以通过电泳分离。不同泳道中相同大小的DNA分子泳动速度相同，因此可以参照DNA Marker中已知大小DNA片段的泳动距离来判断样品中DNA片段的大小。
DNA样品在点样前需要先与上样缓冲液混合，方便样品更好地沉降到上样孔底部，同时有利于观察上样过程和电泳进度。
制胶时在凝胶中加入核酸染料，电泳过程中DNA与染料结合。该染料在紫外光激发下会发出荧光，因此可以在紫外光下观察DNA条带。对应大小的DNA浓度越高，其结合的核酸染料就越多，在紫外光下条带亮度也就越高。