大肠杆菌质粒DNA的小量提取:实验原理

大肠杆菌质粒DNA的小量提取:实验原理

质粒是独立于染色体DNA之外的能够独立复制的DNA分子,大部分为环状结构,主要存在于细菌、酵母等细胞中。质粒可以在宿主细胞内复制,并随着宿主细胞的分裂分配到子代细胞中,质粒上携带的基因也能在合适的宿主细胞中表达。基于这些特性,质粒是重组DNA技术中最常用的载体。一方面可以用于DNA片段在宿主细胞内的复制和保存,另一方面可以通过质粒载体携带的基因片段在宿主细胞内表达,实现相应蛋白质的合成或赋予宿主细胞新的表型。

实验室中常用碱裂解法从大肠杆菌细胞小量制备质粒DNA,该方法操作简便,制备的质粒DNA纯度较高。提取质粒时首先通过离心收集细菌,然后将溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次加入菌体,使菌体裂解,蛋白质和细菌染色体DNA等杂质形成沉淀,质粒DNA则保留在上清液中。离心后将上清液转移至新管中,再经过酚-氯仿抽提、乙醇沉淀、TE缓冲液溶解即可得到纯度较高的质粒DNA溶液。

目前普遍使用的离心柱式质粒小提试剂盒原理是碱裂解法裂解细菌,再通过离心吸附柱在高盐状态下特异结合溶液中的DNA,漂洗后再洗脱收集。试剂盒提取质粒DNA比传统方法操作更简便,制备的质粒DNA纯度和完整性也更好,可以满足常规实验要求。

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