大蒜中超氧化物歧化酶的提取、分离及活性测定:实验原理

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是植物中普遍存在的一种含金属酶,具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎等作用。它与过氧化物酶、过氧化氢酶等协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害;超氧化物歧化酶可以催化氧自由基的歧化反应,生成过氧化氢,过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织或细胞破碎后,可用pH值7.8的磷酸缓冲液提取出来,然后用硫酸铵分级沉淀法进行初步纯化,再用有机溶剂沉淀法将其纯化。

盐析是利用蛋白质等生物大分子物质在高浓度中性盐溶液中溶解度的差异,通过向处理溶液中引入一定浓度的中性盐,使不同溶解度的生物分子先后凝聚析出,从而可以达到不同蛋白质分离的目的。

盐析法中应用最广泛的盐类是硫酸铵,因为它具有温度系数小而溶解度大的优点,并且在其溶解度范围内,许多蛋白质和酶类都可以盐析出来,而且硫酸铵廉价易得,分级沉淀效果比其他盐类好,不容易引起蛋白变性。

有机溶剂沉淀的原理是,有机溶剂能降低水溶液的介电常数,使蛋白质分子之间的静电引力增大,同时,有机溶剂的亲水性比蛋白质分子的亲水性强,它会抢夺本来与亲水蛋白质结合的自由水,破坏其表面的水化膜,导致蛋白质分子之间的相互作用增大而发生聚集,从而沉淀析出。由于SOD不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出。

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