考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。考马斯亮蓝G250能与蛋白质的疏水区相结合，这种结合具有高敏感性，结合反应只需2分钟，此后1小时内结合物颜色能够保持稳定。考马斯亮蓝G250与蛋白质结合生成复合物呈色后，其最大吸收波长从465nm变为595nm，且在一定范围内吸光度与蛋白质含量呈线性关系。而且该蛋白染料复合物吸光系数很高，检测灵敏度很高，可以测定1μg/mL的蛋白质，因此被作为常用的蛋白含量测定方法之一。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，有较高的分辨率。不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动时不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均优于连续系统。由于SDS-PAGE过程中使用了SDS、巯基乙醇等，不同于一般的不连续凝胶系统。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。此外，强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇等能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。因此，SDS-PAGE中蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

SDS-PAGE由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由过硫酸铵（AP）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH值6.8的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH值8.8的Tris-HCl。电极缓冲液是pH值8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。浓缩胶的作用是堆积作用，由于凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶的作用是分离作用，由于分离胶孔径较小，分子量大的蛋白质通过时受的阻力大，泳动慢，分子量小的蛋白通过时受的阻力小，泳动快，最终各种蛋白按分子量大小排列成不同区带。

本实验是对上次提取的纳豆激酶测定激酶蛋白浓度，利用考马斯亮蓝方法测定蛋白含量，然后通过SDS-PAGE电泳测定其纯度。