纳豆激酶的分离纯化:实验原理

纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,分子量为28kD,等电点为8.6。本实验通过硫酸铵盐析法从纳豆中初步提取纳豆激酶,然后运用GE蛋白质纯化系统,通过Sephadex G—25凝胶层析、阳离子交换层析等方法进行逐步纯化。层析过程中收集洗脱液分别进行检测,分析各个峰值,最后对整个纯化方案进行评价。

盐析是蛋白质等生物大分子物质在高浓度中性盐中,由于中性盐夺走水分子,破坏水化膜,暴露蛋白质疏水区域相互结合,同时中和电荷,破坏亲水胶体,使蛋白质分子溶解度降低而沉淀析出的过程。利用蛋白质等生物大分子物质在高浓度中性盐溶液中溶解度的差异,通过向处理溶液中引入一定浓度的中性盐,使不同溶解度的生物分子先后凝聚析出,从而可以达到不同蛋白质分离的目的。盐析法中应用最广泛的盐类是硫酸铵,因为它具有温度系数小而溶解度大的优点,并且在其溶解度范围内,许多蛋白质和酶类都可以盐析出来,而且硫酸铵廉价易得,分级沉淀效果比其他盐类好,不容易引起蛋白变性。

采用硫酸铵进行盐析时,硫酸铵的加入方法有三种:

方法一:直接加入硫酸铵固体。此法常用于工业生产。加入速度不能太快,分批加入,充分搅拌,防止局部浓度过高。

方法二:加入硫酸铵饱和溶液。此法常用于实验室和小规模生产,或硫酸铵浓度不需太高时使用。可防止局部浓度过高,但是加入量多时溶液会被稀释。

方法三:透析法。此法是将盛有蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中,通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。但仅用于精确、小规模实验中。分级盐析,每次加入硫酸铵后需要放置一段时间(0.5~1小时),待沉淀完全后才能过滤或离心。

本实验采用直接加入硫酸铵固体的方法进行分级盐析。

由于使用盐析法提取的纳豆激酶粗品中残存大量盐分,在后续离子交换层析时,对离子交换柱的交换容量和交换效率有影响,因此,本实验在离子交换层析实验前,预先使用凝胶层析对纳豆激酶粗品进行脱盐和除杂处理。

凝胶层析又称分子筛、凝胶过滤、排阻层析等,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中,然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只能留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱;小分子则能自由出入凝胶颗粒,并很快在流动相和静止相间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。凝胶层析是分离纯化实验中一种常用的分离手段,它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好,特别是不改变样品生物学活性等优点,被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。

商品凝胶的种类很多,常用的有葡聚糖凝胶(Sephadex G)及羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH—20)。其中,Sephadex G是由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂(如环氧氯丙烷)交联聚合而成。生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂数量越多即交联度越高,网孔越紧密,孔径越小,吸水膨胀也越小;交联度低,则网孔越稀疏,吸水后膨胀也越大。商品型号即按交联度大小分类,并以吸水量多少表示。此型号凝胶只适用于在水中应用,且不同规格适合分离不同分子量的物质。

Sephadex G—10分离范围<0.7kD。

Sephadex G—15分离范围<1.5kD。

Sephadex G—25分离范围1kD~5kD。

Sephadex G—50分离范围1.5kD~30kD。

Sephadex G—75分离范围3kD~80kD。

Sephadex G—100分离范围4kD~150kD。

Sephadex G—150分离范围5kD~300kD。

Sephadex G—200分离范围5kD~600kD。

Sephadex G—10/15/25特别适用于脱盐、肽与其他小分子的分离,本实验使用Sephadex G—25,对硫酸铵盐析后的纳豆激酶粗品进行脱盐和除杂处理,以免影响后续离子交换层析时的交换容量和交换效率。

离子交换法由于所用介质无毒,可反复再生,少用或不用有机溶剂,已广泛应用到生物分离过程中。离子交换剂是一种不溶于酸、碱、有机溶剂的固态高分子聚合物,它具有立体网状结构并含有活性基团,能与溶剂中其他带电粒子进行离子交换或者吸附,并且离子交换反应是可逆的,可以通过一定溶剂将吸附在离子交换剂上的物质洗脱下来。纳豆激酶的纯化步骤使用离子交换法。纳豆激酶的等电点为8.6,且在pH值6~12的范围性质稳定,因此,本实验选择阳离子交换介质SP Sepharose Fast Flow,以10mmol/L pH值6.4的磷酸缓冲液作为平衡液,用含1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行线性洗脱。

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