蛋白质的纯化一般分为初步纯化和高度纯化两个阶段。

初步纯化即提取过程，以去除与目标产物性质有较大差异的杂质为目的，可采取沉淀、吸附、萃取和膜分离等操作。高度纯化即精制过程，以去除与目标产物性质相近的杂质为目的，可采取凝胶过滤、离子交换、亲和分离、疏水层析等操作。凝胶过滤柱可以根据分子量大小不同而实现蛋白质分离；离子交换树脂柱是利用不同蛋白质等电点不同，在不同pH下所带电荷性质和强弱有差异，将蛋白通过离子交换树脂，不同蛋白因与离子交换树脂具有不同的吸附能力被分级洗脱下来，从而达到蛋白质分离纯化的目的；亲和层析柱是将具有生物亲和作用的两种分子中的一种与支持物共价偶联，作为固定相，特异性吸附另一种分子，从而使另一种分子从混合物中得到选择性分离纯化；疏水层析柱是利用高浓度中性盐使蛋白质疏水部分暴露，以表面偶联弱疏水性基团的介质为固定相，以一定浓度盐溶液为流动相，利用蛋白质表面疏水性程度的差异，不同蛋白质与固定相之间疏水相互作用力的强弱不同，从而实现蛋白质分离。

蛋白质纯化操作一般包括以下四个步骤：

①平衡：用平衡液冲洗柱子，确保柱子处于稳定状态。

②吸附：样品中各组分依据亲和力大小与柱子中吸附剂或者交换剂作用，目标分子结合在吸附剂或者交换剂上，杂质不被吸附从而流出柱子。

③洗脱：洗脱剂与目标分子竞争吸附位点，实现洗脱。通常采用梯度洗脱，逐渐提高洗脱剂浓度，不同蛋白依次洗脱下来。

④再生：洗脱剂冲柱，使吸附剂或者交换剂重新具有吸附能力或者交换能力。

蛋白质纯化系统是目前较为常用的蛋白纯化工具，它具有模块式组成，装卸方便，可任意搭配不同分离原理的各种分离柱或所需的检测器，扩大了使用范围，能满足多种实验需要；使用不同盐浓度的缓冲液，进行多样品分析及工艺探索，配合电磁阀和分部收集器做活性组分收集；流速最高可达100mL/min；结合某些制备层析介质，可以进行各类蛋白质、核酸和天然产物分离纯化工艺的开拓及中试放大工作。因此，蛋白纯化系统已广泛应用到蛋白纯化领域中。蛋白质纯化系统作为蛋白质纯化技术的全自动解决方案，可以自动执行亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶层析等多个纯化步骤，能完整、方便地完成蛋白质的纯化和脱盐，操作简单，是自动、快速、高效的层析仪器，无须复杂的纯化知识和丰富经验即可迅速获得高纯度的目标蛋白。

蛋白质纯化系统的组成一般包括梯度泵系统、进样系统、层析柱系统、检测系统、自动收集系统、数据处理系统等。

梯度泵系统主要提供连续、稳定而精确的液体流量，并且能进行梯度混合和洗脱，可完成缓冲液自动配制。系统压力检测器连接在系统泵上，连续测定系统压力，并能够自动调整流速以避免到任何设定的压力上限，从而保护层析柱。进样系统主要是引入要分离纯化的样品，包括样品泵（进样泵）和上样环。样品泵可以直接把样品上样到层析柱或间接通过毛细管样品环上样。样品泵有压力控制模式，确保压力不变的情况，自动调节流速，防止过大压力对层析柱造成损坏。层析柱系统主要指多柱位阀和连接其上的不同类型的层析柱，多柱位阀可同时连接多根层析柱，并可进行自由切换。多柱位阀可以连接5根以上的层析柱，并进行流向控制，用于自动化的层析柱探索与填料筛选。检测系统包含紫外检测、电导检测、pH检测和温度检测等检测器，可根据实际需要进行单独配置。

自动收集系统可根据收集器按时间、体积、滴数和峰收集，并可延迟收集，组分收集器还具有冷却功能以防止样品过热并保护纯化的样品，可放置多种容量的管架和不同类型的深孔板。数据处理系统可对分离纯化的样品进行详细分析，具有层析柱logbook，追踪层析柱历史记录，如使用次数和柱效等。同时配有在位清洗和柱效测定提醒功能，直接显示熟悉的实验流程和每一步的实验条件，既可直接调用模板，删除添加步骤，也可自行修改每一步的参数，还可以根据实验要求给出实验设计方案，同时改变多个变量，用少量的实验次数得到系统信息，便于条件优化。

蛋白质纯化系统流程示意图如图4-4所示。

本实验以镍柱亲和层析为例，使用蛋白纯化系统对蛋白进行纯化。镍柱亲和层析原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Co ²⁺ 、Fe ³⁺ 发生特殊的相互作用，吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。