发酵培养基的成分及来源

微生物生长所需要的营养物质主要是以有机物和无机盐的形式提供的,小部分由气体物质供给。发酵培养基的组成和配比由所培养的菌种、利用的设备、采用的工艺条件以及原料来源和质量不同而有所差别。因此,需要根据不同要求和情况,考虑所用培养基的成分与配比。但是综合所有培养基的营养成分,发酵培养基的成分中必须包含碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子、前体和产物促进剂、水六大类营养要素。

碳源

凡是能够提供微生物细胞物质和代谢产物中碳素来源的营养物质称为碳源。它是组成培养基的主要成分之一,主要功能有两个:一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架;二是提供菌体合成目的产物的原料。碳源分有机碳源和无机碳源。在各种碳源中,糖类是微生物最好、应用最广泛的碳源,如葡萄糖、糖蜜和淀粉等;其次是醇类、有机酸类和脂类等。在各种糖类作为碳源使用时,单糖优于双糖,己糖优于戊糖,淀粉优于纤维素,纯多糖优于杂多糖和其他聚合物。

实验室内常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、有机酸等。工业发酵中利用碳源主要是糖类物质,如饴糖、玉米粉、甘薯粉、野生植物淀粉,以及麸皮、米糠、酒糟、废糖蜜、造纸厂的亚硫酸废液等。

1.淀粉水解糖

淀粉是由葡萄糖组成的生物大分子。大多数的微生物都不能直接利用淀粉,如氨基酸的生产菌、酒精酵母等。因此,在氨基酸、抗生素、有机酸的生产中,都要求将淀粉进行糖化,制成淀粉水解糖使用。

淀粉水解常用的有酸解法、酶解法、酸酶结合法。在淀粉水解糖液中,主要糖分是葡萄糖;另外,根据水解条件的不同,尚有数量不等的少量麦芽糖及其他一些二糖、低聚糖等复合糖类;除此以外,原料带来的杂质(如蛋白质、脂肪等)及其分解产物也混入糖液中。葡萄糖、麦芽糖和蛋白质、脂肪分解产物(氨基酸、脂肪酸等)等是生产菌的营养物,在发酵中容易被利用;而一些低聚糖类、复合糖等杂质存在,不但降低淀粉的利用率,而且影响到糖液的质量,降低糖液中可发酵成分的利用率。在谷氨酸发酵中,淀粉水解糖液质量的高低往往直接关系到谷氨酸菌的生长速率及谷氨酸的积累。因此,如何提高淀粉的出糖率,保证水解糖液的质量,满足发酵的要求,是一个不可忽视的重要环节。

2.糖蜜

糖蜜也是工业发酵常用的碳源,它是制糖工业、甘蔗糖厂或甜菜糖厂的一种副产品。糖蜜含有相当数量的发酵性糖,而且成本低,是生物工业大规模生产的良好原料。

糖蜜原料中,有些成分不适用于发酵,所以在使用糖蜜原料时,一般要先进行预处理,以满足不同发酵产品的需求。例如,在使用糖蜜原料发酵生产谷氨酸时,必须想方设法降低糖蜜中生物素含量,一般用活性炭处理法、树脂法吸附生物素等方法进行预处理。

氮源

凡能提供微生物生长繁殖所需氮素的营养物质皆为氮源。氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类:有机氮源和无机氮源。

1.有机氮源

常用的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟等。

有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外,往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。

尿素也是常用的有机氮源,但它成分单一,不具有上述有机氮源成分复杂、营养丰富的特点,但在青霉素和谷氨酸等发酵生产中也常被采用。尤其是在谷氨酸生产中,尿素可使α酮戊二酸还原并氨基化,从而提高谷氨酸的生产。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外,有的还是产物的前体。例如,缬氨酸、半胱氨酸和α氨基己二酸是合成青霉素和头孢菌素的主要前体;甘氨酸可作为L丝氨酸的前体等。

2.无机氮源

常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般较快,但无机氮源的迅速利用常会引起ph的变化。例如,在制液体曲时,用NaNO3作氮源,菌丝长得粗壮,培养时间短,且糖化力较高。这是因为由NaNO3代谢而得到的NaOh可中和曲霉生长中所释放出的酸,使ph稳定在工艺要求的范围内。又如,在黑曲霉发酵过程中用硫酸铵作氮源,可使培养基ph下降,而这对提高糖化型淀粉酶的活力有利,且较低的ph还能抑制杂菌的生长,防止污染。氨水在许多抗生素的生产中普遍使用。如在红霉素的生产工艺中以氨作为无机氮源可提高红霉素的产率和有效组分的比例,但由于氨水碱性较强,需分批次过滤除菌后少量多次地加入,并且应加强搅拌。

无机盐及微量元素

微生物在生长繁殖和生产过程中,需要某些无机盐和微量元素。无机盐和微量元素是指除碳、氮元素外其他各种重要元素及其供体。它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分,维持生物大分子和细胞结构的稳定性,调节并维持细胞的渗透压平衡,控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。

无机盐和微量元素根据微生物对其需求量的大小不同,有大量元素和微量元素之分。一般微生物对大量元素的需求浓度为10-4~10-3 mol·L-1,常以盐的形式加入,如磷酸盐、硫酸盐以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。微生物的生长还需要某些微量元素,如钴、铜、硒、锰、锌等,这些元素的需要量极其微小,通常在10-8~10-6mol·L-1(培养基中含量)。 除了合成培养基外,一般在天然培养基中不再另外单独加入无机盐和微量元素。因为天然培养基中的许多动、植物原料(如花生饼粉、黄豆饼粉、蛋白胨等)都含有多种微量元素,但有些发酵工业中也有单独加入微量元素的。例如生产维生素B12时,尽管采用天然复合材料做培养基,但因钴元素是维生素B12的组成成分,其需求量是随产物量的增加而增加,所以,在培养基中就需要加入氯化钴以补充钴元素的不足。

1.磷酸盐

磷是某些蛋白质和核酸的组成成分,也是二磷酸腺苷(ADp)、三磷酸腺苷(ATp)的组成成分,在代谢途径的调节方面起着很重要的作用。一般培养基中磷元素充足能促进微生物的生长。如黑曲霉NRRL330菌种生产α淀粉酶时,若加入0.2%磷酸二氢钾,则活力可比低磷酸盐提高3倍。但磷元素过量时,有些次级代谢途径也会受到抑制,次级代谢产物的合成常受抑制。例如,在谷氨酸的合成中,磷浓度过高就会抑制6磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,使菌体生长旺盛,而谷氨酸的产量却很低,代谢向缬氨酸方向转化。磷元素的主要供体–磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。

微生物对磷的需要量一般为0.005~0.01mol·L-1。工业生产上常用K3pO4·3h2O、K3pO4和Na2hpO4·12h2O、Nah2pO4·2h2O等磷酸盐,也可用磷酸(h3pO4)。K3pO4·3h2O含磷13.55%,当培养基中用量在1~1.5g·L-1时,磷浓度为0.0044~0.0066mol·L-1。Na2hpO4·12h2O含磷8.7%,当培养基中用量在1.7~2.0g·L-1时,磷浓度为0.0048~0.00565mol·L-1。磷酸含磷3.16%,当培养基中用量在0.5~3.7g·L-1时,磷浓度为0.005~0.007mol·L-1。如果使用磷酸,应先用NaOh或KOh中和后加入。另外,玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。

2.硫酸镁

镁是某些细菌的叶绿素的组成成分,虽不参与任何细胞结构物质的组成,但它的离子状态是许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌(如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌)对自身所产的抗生素的耐受能力。另外,如果镁离子含量太少,还会影响基质的氧化。一般革兰阳性菌对Mg2+的最低要求量是25mg·L-1;革兰阴性菌为4~5mg·L-1。MgSO4·7h2O中含Mg2+ 9.87%,发酵培养基用量为0.25~1g·L-1时,Mg2+浓度25~90mg·L-1。

硫存在于细胞的蛋白质中,是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基团,如辅酶A、硫锌酸和谷胱甘肽等。在某些产物(如青霉素、头孢菌素等分子)中均含硫,所以在这些产物的生产培养基中,需要加入硫酸镁等硫酸盐作为硫源。而如硫化氢、硫化亚铁等还原态的硫化物,对大多数发酵用微生物是有毒的,一般不能作为硫源。

3.钾、钠、钙、铁盐

钾不参与细胞结构物质的组成,它与细胞渗透压和透性有关,是许多酶的激活剂。钾对谷氨酸发酵有影响;钾盐少,长菌体;钾盐足够,产谷氨酸。菌体生长需钾量约为0.1g·L-1(以K2SO4计,下同),谷氨酸生成需钾量为0.2~1.0g·L-1。当培养基中使用1g·L-1 K3pO4·3h2O时,钾浓度约为0.38g·L-1。如果采用Na2hpO4·12h2O时,应配用0.3~0.6g·L-1 KCl,此时钾浓度为0.35~0.7g·L-1。

钠离子与维持细胞渗透压有关,故在培养基中常加入少量钠盐,但用量不能过高,否则会影响微生物生长。

钙离子主要控制细胞透性。常用的碳酸钙本身不溶于水,几乎是中性的,但它能与代谢过程中产生的酸起反应,形成中性化合物和二氧化碳,后者从培养基中逸出,因此碳酸钙对培养液的ph有一定的调节作用。在配制培养基时要注意两点:一是培养基中钙盐过多时,会形成磷酸钙沉淀,降低了培养基中可溶性磷的含量,因此,当培养基中磷和钙均要有较高浓度时,可将两者分别灭菌或逐步补加;二是先要将配好的培养基用碱调ph近中性,才能将CaCO3加入培养基中,这样可防止CaCO3在酸性培养基中被分解,而失去其在发酵过程中的缓冲能力,同时所采用的CaCO3要对其中CaO等杂质含量做严格控制。

铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分,因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。工业生产上一般用铁制发酵罐,在一般发酵培养基中不再加入含铁化合物。

4.氯离子

氯离子在一般微生物中不具有营养作用,但对一些嗜盐菌来讲是必需的。此外,在一些产生含氯代谢物(如金霉素和灰黄霉素等)的发酵中,除了从其他天然原料和水中带入的氯离子外,还需加入约0.1%氯化钾以补充氯离子。啤酒在糖化时,氯离子含量在20~60mg·L-1范围内能赋予啤酒柔和的口味,并对酶和酵母的活性有一定的促进作用,但氯离子含量过高会引起酵母早衰,使啤酒带有咸味。

5.微量元素

微量元素大部分作为酶的辅基和激活剂。例如,锰是某些酶的激活剂,羧化反应必须有锰参与;在谷氨酸生物合成途径中,草酰琥珀脱羧生成α酮戊二醛是在Mn2+存在下完成的。一般培养基配用2mg·L-1 MnSO4·4h2O。

生长因子

从广义上讲,凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质,如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等,均称生长因子。生长因子不是对于所有微生物都必须的,它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。如目前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株,均为生物素缺陷型,需要生物素作为生长因子。又如肠膜状明串珠菌的生长需要补充10种维生素、19种氨基酸、3种嘌呤以及尿嘧啶。生长因子主要功能维生素B1脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基维生素B2黄素蛋白的辅基,与氢的转移有关维生素B6辅基,与氨基酸的脱羧、转氨基有关生物素各种羧化酶的辅基维生素B12钴酰胺的辅酶,与甲硫氨酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成和异构化有关叶酸辅酶F,与核酸的合成有关泛酸乙酰载体的辅基,与酰基转移有关维生素K电子传递尼克酸脱氢酶的辅基

有机氮源是这些生长因子的重要来源。多数有机氮源含有较多的B族维生素、微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。例如,玉米浆和麸皮水解液能提供生长因子,特别是玉米浆,因含有丰富的氨基酸、还原糖、磷、微量元素和生长素,所以是多数发酵产品良好的有机氮源。

前体和产物促进剂

在某些工业发酵过程中,发酵培养基中除了有碳源、氮源、无机盐、生长因子和水分等成分外,考虑到代谢控制,还需要添加某些特殊功用的物质。将这些物质加入到培养基中有助于调节产物的形成,而并不促进微生物的生长。例如某些氨基酸、抗生素、核苷酸和酶制剂的发酵需要添加前体物质、促进剂、抑制剂及中间补料等。添加这些物质往往与菌种特性和生物合成产物的代谢控制有关,目的在于大幅度提高发酵产率,降低成本。

1.前体

前体指加入到发酵培养基中,能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去,其自身的结构并没有多大变化,但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。前体最早是在青霉素的生产过程中发现的。在青霉素生产中,人们发现加入玉米浆后,青霉素单位可从20U·mL-1增加到100U·mL-1,进一步研究后发现了发酵单位增长的主要原因是玉米浆中含有苯乙胺,它能被优先合成到青霉素分子中去,从而提高了青霉素G的产量。在实际生产中,前体的加入不但提高了产物的产量,还显著提高产物中目的成分的比重。如在青霉素生产中加入前体物质苯乙酸增加青霉素G产量,而用苯氧乙酸作为前体则可增加青霉素V的产量。

大多数前体(如苯乙酸)对微生物的生长有毒性,在生产中为了减少毒性和增加前体的利用率,通常采用少量多次的流加工艺。

产品前体物质青霉素G苯乙酸及其衍生物青霉素V苯氧乙酸金霉素氯化物灰黄霉素氯化物红霉素正丙醇核黄素丙酸盐类胡萝卜素β紫罗酮L异亮氨酸α氨基丁酸L色氨酸邻氨基苯基甲酸L丝氨酸甘氨酸

2.产物合成促进剂

所谓产物合成促进剂,是指那些细胞生长非必需的,但加入后却能显著提高发酵产量的物质。它们常以添加剂的形式加入发酵培养基中。如栖土曲霉3942生产蛋白酶时,在发酵2~8h时添加0.1% LS洗净剂(即脂肪酰胺磺酸钠),就可使蛋白酶产量提高60%。在生产葡萄糖氧化酶时,加入金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对酶的形成有显著影响,酶活力随EDTA用量的增加而递增。又如添加大豆油抽提物后,米曲霉所产蛋白酶的量可提高87%,脂肪酶可提高150%。

添加剂酶微生物酶活力增加倍数Tween(0.1%)纤维素酶许多真菌20蔗糖酶许多真菌16β葡聚糖酶许多真菌10木聚糖酶许多真菌4淀粉酶许多真菌4脂酶许多真菌6右旋糖酐酶绳状青霉QM42420普鲁兰酶产气杆菌QMB15911.5大豆酒精提取物(2%)蛋白酶米曲霉1.87脂酶泡盛曲霉2.50植酸盐(0.01%~0.3%)

目前,人们对促进剂提高产量的机制还不完全清楚,原因可能有多种:如在酶制剂生产中,有些促进剂本身是酶的诱导物;有些促进剂是表面活性剂,可改善细胞的透性,改善细胞与氧的接触,从而促进酶的分泌与生产,也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用;有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子等等。

各种促进剂的效果除受菌种、菌龄的影响外,还与所用的培养基组成有关,即使是同一种产物促进剂,用同一菌株,生产同一产物,在使用不同的培养基时效果也会不一样。另外,促进剂的专一性较强,往往不能相互套用。

水是所有培养基的主要组成成分,也是微生物机体的重要组成成分。对于发酵工厂来说,洁净、恒定的水源是至关重要的,因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。例如,在抗生素发酵工业中,水质好坏有时是决定一个优良的生产菌种在异地能否发挥其生产能力的重要因素。另外,水中的矿物质组成对酿酒工业和淀粉糖化影响也很大。因此,在决定建造发酵工厂的地理位置时,应考虑附近水源的质量,主要考虑的指标包括ph值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量等。

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