1 防止种子带菌

种子带菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，以说明是否有种子带菌。种子带菌的原因主要有：保藏的斜面试管菌种染菌；培养基和器具灭菌不彻底；种子转移和接种过程染菌；种子培养所涉及的设备和装置染菌。

种子制备过程中，对沙土管及摇瓶要严格加以控制。沙土制备时，要多次间歇灭菌，确保其无菌；子瓶、母瓶的移种和培养时，要严格要求无菌操作；无菌室和摇床间都要保持清洁。

无菌室的具体要求有：无菌室面积不宜过大，一般约4～6m2，高约2.6m。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1～3个缓冲间。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温度、湿度。无菌室的每个缓冲间一般都用紫外线灭菌。通常用30Ｗ紫外线灭菌灯照射20～30min即可。

无菌室的含菌要求有：根据一般工厂的经验，无菌室内无菌培养皿平板开盖放置30min后，培养长出的菌落在3个以下为好。

无菌室每次使用时间不宜过长。人员进入需要更衣，换鞋，戴帽，操作时手要用75％酒精棉擦拭干净，用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。

2  防止设备渗漏

发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损，以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备一旦渗漏，就会造成染菌。例如，冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中导致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。

冷却管是发酵罐中最容易渗漏的部件之一。由于发酵液具有一定的酸度和含有某些腐蚀性强的物质（如亚硫酸盐、硫酸铵等），冷却管很易受到腐蚀。发酵液中固体物料搅动引起的磨损、冷却介质中的化学成分和流动时的冲击，以及加热时蒸汽冲击的影响，也会引起腐蚀及磨损。而最易穿孔的部分是冷却列管的弯曲处，原因是弯曲处外壁减薄和加热煨弯时使材料的性质有所改变所致。冷却介质的压力通常大于罐压，如果有微孔，冷却介质就会进入发酵液而引起染菌。

设备的渗漏如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小渗漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现。试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力时，关闭进出水，看压力是否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以将稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，酚酞能变红处即为渗漏处。

阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力（一般１kg以上），由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。

3 防止培养基灭菌不彻底

培养基灭菌前含有大量杂菌；灭菌时如果蒸汽压力不足，达不到要求的灭菌温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积等等：这些都会造成灭菌培养基不彻底。

工业发酵的主要原料一般来自于农产品，包括谷物、水果等，它们为发酵微生物提供营养成分。但如果储藏不当就会产生大量杂菌污染，从而影响培养基的灭菌效果。因此，采用优质原料制备培养基是保证发酵正常的重要条件。

空罐预消毒或实罐灭菌时，均应充分排净发酵罐内的冷空气，这样在通入高温高压蒸汽时，发酵罐内能够达到规定的灭菌压力，保证达到要求的灭菌温度。同时，灭菌结束、开始冷却时，因蒸汽冷凝而使罐压突然降低甚至会形成真空，此时必须将无菌空气通入罐内保持一定压力，以免外界空气进入引起杂菌污染。

蒸汽灭菌时产生大量泡沫的原因有：培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，即不能被杀死。防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。

灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效到达，常会窝藏嗜热芽孢杆菌。因此，设备安装时，要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。

4  防止空气引起的染菌

无菌空气带菌是引起发酵染菌的重要原因，要控制无菌空气带菌，就要从空气的净化流程和设备的选择、过滤介质的选材和装填、过滤器灭菌和管理方法的完善等方面来强化空气净化系统。

压缩空气需要选择良好的气源。例如，高空采气，将工厂建立在郊区，或者是安装高效的空气粗滤器。使进入压缩机的空气含菌数和含尘数尽可能低。

以棉花活性炭为过滤介质的过滤器长期使用后，棉花和活性炭因被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大，空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边因长期受空气顶吹而使棉花和活性炭改变位置，造成过滤器失效。发现此种情况应立即重新装填或予以更换。

过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿，就会降低或丧失过滤效能，所以灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。

超细纤维纸作过滤介质的过滤器，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。

在实际生产过程中，无菌空气管道大多与其他物料管道相连接，因此必须装上止回阀，防止其他物料逆流窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。

目前，国内的膜过滤技术已比较成熟，如用聚偏氟乙烯（pVDF）制成的折叠式微孔滤膜不仅过滤精度高，且流量大。只要注意进气粗滤除尘及压缩后除湿脱油，并按规范对过滤器进行定期灭菌，即可保证空气无菌。另外，由于pVDF膜疏水性强，对压缩空气中的水分不敏感，因此可解决空气湿度过大时其他介质过滤器不能使用的问题。

5 发酵染菌后的措施

1.种子染菌后的措施

一旦发现种子罐被杂菌污染，应立即停止接种，种子罐灭菌后排放，对与种子罐连接的物料、供气等所有管道进行彻底灭菌。与此同时，将未受污染的正常种子接入发酵罐中，以保证生产的连续性。如无备用的种子，则可选择一罐菌体生长旺盛的发酵液进行分罐发酵，从而保证生产的正常进行。

2.发酵前期染菌后的措施

①发酵初期发生染菌，培养基中的碳、氮源含量基本不变，可终止发酵，将培养基重新进行灭菌处理后，接入种子进行发酵。

②如果染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。

③如果染菌情况轻微而发现较晚时，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，也可采取降温培养、调节ph、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。

3.发酵中、后期染菌后的措施

①发酵中、后期发现染菌，可以适当地加入杀菌剂或抗生素，补加正常的发酵液，以抑制杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施进行处理。

②在接近发酵后期出现染菌现象，如杂菌量不大，可继续发酵。如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可采取措施提前放罐。

③对于没有提取价值的发酵液，应加热至120℃以上，保持30min后排放废弃。

4.染菌后对设备的处理

发生染菌的发酵罐要查明染菌原因，如果是设备问题要及时加以维修。设备重新使用前要进行严格检查，并进行彻底清洗，空罐加热灭菌至120℃以上，保持30min后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。