柱层析技术又称柱色谱技术。在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品洗脱的过程中，不同组分在层析柱中行进速度不同，从而实现各组分分离。常见的柱层析技术分为离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水作用层析等。
1.离子交换层析
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。按活性基团性质（交换基或官能团）分为阳离子交换树脂（强酸型、弱酸型）和阴离子交换树脂（强碱型、弱碱型）。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子交换树脂。离子交换层析常用于蛋白质的分离纯化。蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况不同。阴离子交换基质结合带正电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带负电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或提高洗脱液的pH值洗脱下来。